COD PROIECT
PN-II-PT-PCCA-2013-4-1953/199/2014

TITLU PROIECT

Dezvoltarea unui medicament pe bază de plante cu administrare topică în dermatoze alergice

Development of a herbal medicinal product with topical administration in allergic dermatitides

DIRECTOR PROIECT: PROF. DR. MIHAELA DINU

ACRONIMUL PROIECTULUI:
TOPDERMAL

PARTENERI:

1. UNIV.DE MEDICINA SI FARMACIE “CAROL DAVILA”, BUCUREŞTI

2. HOFIGAL EXPORT IMPORT SA

3. AGROECO BIOTERRA SRL

4. UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA

REZUMAT:

Disfuncţiile imunologice cu manifestări cutanate, precum urticaria, dermatita de contact sau dermatita atopică sunt probleme sociale care afectează o parte considerabilă a populaţiei, în special cea din ţările dezvoltate. Efectele adverse care însoţesc tratamentul topic cu medicamentele existente limitează utilizarea acestora la unii pacienţi. Prin intermediul proiectulului urmărim dezvoltarea şi obţinerea cu ajutorul biotehnologiilor a unui produs original – medicament de uz topic pe bază de plante util în tratamentul afecţiunilor cutanate mediate imunologic, contribuind astfel la creşterea calităţii vieţii pacienţilor afectaţi.  Produsul va asigura tratamentul unor patologii care afectează un număr mare de bolnavi, atât la nivel naţional cât şi internaţional. Deşi materialul vegetal utilizat iniţial pentru definirea extractului standardizat va proveni din culturi ecologice (riscul de contaminare cu alergeni chimici neexistând), obiectivul final îl constituie producerea acestuia prin intermediul biotehnologiilor, astfel încât să se poată obţine materia primă activă în cantităţi adecvate, de puritate acceptabilă şi independent de culturile sezoniere.

În acest scop se va explora conţinutul în biocompuşi cu potenţială acţiune antialergică dintr-un număr de 6 specii vegetale selectate şi corelaţia acestora cu acţiunea antialergică (inclusiv la nivel imunologic), pentru purificarea ulterioară şi obţinerea extractului activ farmaceutic. Acesta va asigura identificarea speciei, extractului şi fracţiunii cu cea mai mare eficacitate (în indicaţia de interes – alergii care se pretează la tratament topic) şi siguranţă demonstrată în modele preclinice. Se va dezvolta o biotehnologie (culturi de ţesuturi vegetale) de obţinere a componentei active a unui medicament de uz topic cu acţiune antialergică, identificate pe baza datelor farmacologice şi biochimice şi se vor evalua variabilele care afectează calitativ şi cantitativ caracteristicile biomasei obţinute în cultura de ţesuturi, inclusiv compoziţia în principii active de interes. Aceasta va permite optimizarea procesului biotehnologic de obţinere a extractului standardizat ce va constitui substanţa activă a medicamentului de uz topic.

Până în prezent, niciun studiu ştiinţific nu a raportat investigarea acţiunii antialergice la nivel topic a unor extracte vegetale purificate din aceste specii şi nici nu s-a examinat corelaţia unei acţiuni de acest gen cu efectele imunologice şi cu clasele de fitocompuşi răspunzătoare de aceste acţiuni. Pe piaţa românească sunt comercializate câteva produse de natură vegetală în această arie terapeutică, însă nu au fost dezvoltate ştiinţific şi nu sunt autorizate ca medicamente (nefiind incluse în Nomenclatorul oficial elaborat de Agenţia Naţională a Medicamentului şi a Dispozitivelor Medicale), ci (probabil) ca dispozitive medicale, ceea ce înseamnă că acţionează în principal printr-un efect mecanic, de barieră sau prin asigurarea hidratării şi nu printr-o acţiune antiinflamatoare/antialergică propriu-zisă, de natură farmacologică.
Proiectul se va realiza în urma colaborării a patru parteneri: Universitatea de Medicină şi Farmacie "Carol Davila" Bucureşti (cu o echipă multidisciplinară de experţi in botanică farmaceutică, fitochimie, farmacologie, biochimie, chimie farmaceutică, chimie fizică, tehnologie farmaceutică), Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară Bucureşti (cu o echipă de experţi în domeniul biotehnologiei), SC Hofigal Export Import (unul dintre cei mai importanţi producători de medicamente de origine de origine vegetală de pe piaţa romanească) şi SC Agroeco Biottera SRL (o companie specializată în cultivarea ecologică a speciilor medicinale vegetale).

SUMMARY

Immunological dysfunctions with cutaneous manifestations, such as urticaria, contact dermatitis or atopical dermatitis are social problems affecting a considerable part of the population, especially in the developed countries. Adverse effects accompanying the topical treatment with the current medicinal products limit their use for all the patients. Through this project we aim at developing and obtaining by technologies an original product – a herbal medicinal product of topical use intended in the treatment of cutaneous conditions mediated immunologically, thus contributing to the increase of the quality of life of the affected patients. The product will ensure the treatment of pathologies affecting a high number of patients, both at the national and international level. Although the herbal material initially used to define the standardized extract will be derived from ecological cultures (the risk of contamination with chemical allergenes being non-existent), the final objective is its production through biotechnologies, so as to allow the obtaining of the active raw material in appropriate amounts, of acceptable purity and independently of the seasonal cultures.

       For this purpose the content in biocompounds with antiallergic potential activity from 6 herbal species  will be explored, as well as their correlation with the antiallergic activity (also at immunological level), for their later purification and obtaining of the pharmaceutical active extract. This will ensure the identification of the species, extract and fraction with the highest efficacy (in the indication of interest – allergies which may be treated topically) and safety proven in preclinical models. A biotechnology (cultures of plant tissues) of obtaining the active component of a topical medicinal product with antiallergic activity, identified based on the pharmacological and biochemical data and the variables affecting qualitatively and quantitatively the characteristics of the biomass obtained in the tissue culture, including the composition in active principles of interest, will be assessed. This will allow optimisation of the biotechnological process of obtaining the standardized extract that will constitute the active substance of the medicinal product for topical use.

       Until now, no scientific study has reported the investigation of the antiallergic activity at topical level of purified extracts from these species or has examined the correlation of such an activity with the imunological effects and the classes of phytochemicals responsible for this activity. On the Romanian market several products of herbal nature are marketed in this therapeutical area, but they have not been developed scientifically and are not authorized as medicinal products (being not listed in the official Register drawn out by the National Agency for Medicines and Medical Devices), but (probably) as medical devices, which means that they act mainly through a mechanical effect, of barrier or by ensuring hydration, but not by an anti-inflammatory/antiallergic activity proper, of a pharmacological nature.

       The project will be realized by the collaboration of three partners: The University of Medicine and Pharmacy “Carol Davila” Bucharest (with a multidisciplinary team of experts in pharmaceutical botany, phytochemistry, pharmacology, biochemistry, pharmaceutical chemistry, physical chemistry and pharmaceutical technology), the University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine Bucharest (with a team of experts in the field of biotechnology), SC Hofigal Export Import (one of the most important producers of medicines of herbal origin on the Romanian market) and SC Agroeco Biottera SRL (a company specialized in the ecological cultivation of herbal medicinal species).

OBIECTIVE:

1. Dezvoltarea unei biotehnologii (culturi de ţesuturi vegetale) de obţinere a componentei active a unui medicament de uz topic cu acţiune antialergică

2. Dezvoltarea unui produs farmaceutic cu componenta activă astfel obţinută;

3. Screening-ul farmacologic a unor specii vegetale cu potenţial antialergic, în vederea identificării plantelor cu eficacitate (în indicaţia de interes – efect antialergic) şi siguranţă demonstrată în modele preclinice;

4. Evaluarea conţinutului în compuşi fitochimici din extractele investigate;

5. Evaluarea procedeelor de extracţie, şi respectiv, purificare,  pentru optimizarea componentei active;

6. Evaluarea mai multor variabile care afectează calitativ şi cantitativ caracteristicile biomasei obţinute în cultura de ţesuturi;

REZULTATELE ESTIMATE:

1. Obţinerea componentei active a unui medicament de uz topic cu acţiune antialergică;

2. Obţinerea unui produs farmaceutic cu componenta activă astfel rezultată;

3. Identificarea speciei vegetale cu eficacitate maximă (în indicaţia de interes – alergii care se pretează la tratamentul topic) şi siguranţă demonstrată în modele preclinice

4. Identificarea compuşilor fitochimici;

5. Identificarea celui mai bun procedeu de extracţie şi, respectiv, purificare, în vederea obţinerii componentei active;

6. Identificarea variabilelor care afectează calitativ şi cantitativ caracteristicile biomasei în sensul dorit;

REZULTATE OBȚINUTE:

Etapa 1 (2014)

Activitățile de cercetare desfășurate în această etapă au constat în :

Cultivarea materialului vegetal în culturi biologice. Au fost cultivate și recoltate speciile: Anghinara (Cynara scolymus L.), Dud alb (Morus alba L.), Motul curcanului (Amaranthus caudatus L./A. hypochondriacusL.),Patlagina (Plantago lanceolata L.), Soc (Sambucus nigra L.), Zmeur (Rubus idaeus L.).

Sortarea materialului vegetal și verificarea identității și calitățiiacestuia. Au fost sortate organele de interes pentru fiecare material vegetal în parte. Verificarea identității s-a efectuat prin examen macroscopic, microscopic; Au fost determinați parametrii preliminari de calitate;

A fost evaluată compoziția calitativă și cantitativă (prin metode spectroscopice – spectrofotometrie UV/VIS și cromatografice – HPLC/DAD) a materiilor prime; În cadrul aceleiași activități a fost urmărită influența solventului asupra extracțiilor principiilor active de interes. Solventul optim pentru extracția principiilor active a fost în toate cele 6 situații etanolul 50%.

Au fost obținute 5 extracte totale uscate din speciile vegetale: anghinara (Cynara scolymus L.), dud alb (Morus alba L.), motul curcanului(Amaranthus  hypochondriacus L.),pătlagina (Plantago lanceolata L.),soc (Sambucus nigra L.).

Extractele obținute au fost caracterizate prin metode spectrometrice și cromatografice (identificare prin IR, UV, HPLC și determinare cantitativă prin spectrofotometrie UV/VIS – totalul flavonoidic – metoda de complexare cu AlCl3 și Folin Ciocalteu).

A fost dezvoltat un model farmacologic pe animale de laborator (șoareci) pentru dermatita atopică prin hipersensibilizare indusă de DNFB. Modelul a fost efectuat pe loturi a câte 5 animale cu respectarea normellor de bioetică în cercetarea pe animale de experienţă în scop ştiinţific, conform Legii 43/2014 privind protecția animalelor utilizate in scopuri științifice și Directivei 2010/63/UE a Parlamentului European şi a Consiliului din 22 septembrie 2010, privind protecţia animalelor utilizate în scopuri ştiinţifice.

Toate aceste activități științifice și de cercetare au condus la atingerea obiectivelor propuse și la obținerea livrabilelor următoare:

- pagina web a proiectului: http://topdermal.umf.ro/

EM(1): model experimental de obţinere a extracte totale uscate: 5 - extracte totale uscate;

EM(2): model experimental - model farmacologic de dermatită atopică;

Etapa 2 (2015)

I. Obiectivele etapei:

WP1. Obţinerea şi caracterizarea fizico-chimică a extractelor vegetale

1.1. Obţinerea extractelor totale.

1.2. Evaluarea conţinutului în biocompuşi a extractelor totale.

WP2. Dezvoltarea şi optimizarea biotehnologiei de producere in vitro a materialului vegetal

2.1. Obţinerea explantelor

2.2. Obţinerea calusurilor (ţesuturilor) prin cultivare in vitro

2.3. Obţinerea extractului total din biomasă şi evaluarea conţinutului în biocompuşi activi

WP3. Evaluarea acţiunii antialergice şi a toxicităţii extractelor vegetale

3.1. Evaluarea cito/genotoxicităţii extractelor totale.

3.2. Evaluarea acţiunii antialergice a extractelor vegetale totale.

II. Livrabilele estimate corespunzătoare obiectivelor sunt:

L1. EM(1): Model experimental de obţinere a extracte totale uscate: 1 extract total uscat;
L2. EM(3): model citotoxic pe celula vegetală (CI50%)
L3. EM(4): model citotoxic pe celula animală (CL50%);
L4. FM(1): un model farmacologic pentru toate cele 6 extracte vegetale totale;
L5. Diseminare: 1 articol ISI

Pentru obţinerea livrabilelor activităţile au fost împărţite în 8 faze (activităţi) astfel:

Activitatea 2.1. Producerea materialului vegetal în culturi ecologice şi verificarea/confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale. Partea a II-a.

Activitatea 2.2. Evaluarea conţinutului în biocompuşi a speciilor vegetale cultivate ecologic. Partea a II-a.

Activitatea 2.3. Obţinerea extractelor totale şi evaluarea conţinutului în biocompuşi. Partea a II-a.

Activitatea 2.4. Evaluarea cito/genotoxicităţii extractelor vegetale totale

Activitatea 2.5. Evaluarea acţiunii antialergice topice a extractelor totale

Activitatea 2.6. Obţinerea explantelor şi inducerea calusurilor

Activitatea 2.7. Obţinerea de biomasă produsă prin biotehnologie

Activitatea 2.8. Diseminarea rezultatelor

Toate activităţile ştiinţifice şi de cercetare au condus la atingerea obiectivelor propuse şi la obţinerea următoarelor livrabile:

L1. EM(1): Model experimental de obţinere a extracte totale uscate: 1 extract total uscat; S-a obţinut un extract uscat din frunze de Rubus idaeus şi a fost caracterizat prin dozarea flavonelor, polifenolilor totali, analiza HPLC şi IR. Solventul de extracţie a fost selectat prin compararea rezultatelor evaluării soluţiilor extractive obţinute cu trei tipuri de solvent (dozarea flavonozidelor, polifenolilor totali, analiza HPLC, IR) ;
L2. EM(3): model citotoxic pe celula vegetală (CI50%) - Test Triticum;
L3. EM(4): model citotoxic pe celula animală (CL50%);- Test Daphnia;
L4. FM(1): un model farmacologic pentru toate cele 6 extracte vegetale totale; S-au utilizat şoareci BALB/c/Br, femele după sensibilizare prin contact cu DNFB. S-a realizat  tratament cu extractele studiate, apoi s-a evaluat eficienţa prin măsurarea modificării grosimii urechii stângi comparativ cu dexametazona şi dozarea fluorimetrică a histaminei serice. S-a determinat cel mai eficace extract vegetal dintre cele şase testate. Specia de la care a provenit acesta a fost utilizată pentru obţinerea unei culturi de ţesuturi in vitro, iar din biomasa  rezultată s-a obţinut un extract uscat, caracterizat similar celor anterioare.

Rezultatele științifice ale proiectului au fost diseminate prin:

- pagina web a proiectului: http://topdermal.umf.ro/

- participarea la conferințe de specialitate cu lucrări științifice (poster):

1. Anghel AA, Ancuceanu RV, Dinu MD, Hovanet MV, Olaru O, Plants With Therapeutical Potential In Immune-Mediated Skin Diseases, Volum de rezumate al "Enviroment and Public Health" MED ENV 2014, Constanța, 12-14 Septembrie 2014, p.144

2. Olaru OT, Potolea IM, Pîrvu OM, Rusînac AM, Spînu CE, Dinu MD, Nitulescu GM, Cytotoxicity screening of several extracts fromConsolida regalis Gray. using Daphnia magna and Physa acutabioassays, Volum rezumate al Simpozionului international Prioritatile Chimier pentru o Dezvoltare Durabila – PRIOCHEM, 30-31 oct. 2014

3. Anghel Adriana Iuliana, Ancuceanu Robert Viorel, Hovaneţ Marilena Viorica, Dinu Mihaela. Sesiunea de comunicări ştiinţifice"D.Brândză", Bucureşti, 7 noiembrie 2015. Evaluarea conţinutului în polifenoli, flavonozide şi investigarea citotoxicităţii unui extract din frunzele speciei Sambucus nigra L.

4. Mihaela DINU, Octavian Tudorel OLARU, Alina DUNE, Carmen POPESCU, George Mihai NITULESCU, Robert Viorel ANCUCEANU, The obtaining and characterization of a rich-phenolic extract from Amaranthus hypochondriacus L., Revista de Chimie, 2016. 67 (in press).

Etapa 3 (2016)

I. Obiectivele etapei:

WP1. Obţinerea şi caracterizarea fizico-chimică a extractelor vegetale

1. Obţinerea unor fracţiuni (extracte purificate) ale extractului total cel mai activ.

2. Evaluarea conţinutului în biocompuşi a extractelor purificate.

WP2. Dezvoltarea şi optimizarea biotehnologiei de producere in vitro a materialului vegetal

3. Obţinerea explantelor

4. Obţinerea calusurilor (ţesuturilor) prin cultivare in vitro

5. Obţinerea extractului total din biomasă şi evaluarea conţinutului în biocompuşi activi

6. Evaluarea influenţei factorilor determinanţi asupra randamentului de obţinere a biomasei şi/sau principiilor active

WP3. Evaluarea acţiunii antialergice şi a toxicităţii extractelor fracționate

7. Evaluarea cito/genotoxicităţii

8. Evaluarea acţiunii antialergice

II. Livrabilele estimate corespunzător obiectivelor sunt:

EM(5): Model experimental (1) de obţinere a extractelor purificate: extracte purificate uscate (cel puțin 3 extracte purificate)

EM(6): model citotoxic pe celula vegetală pentru extractele purificate (CI50%)

EM(7): model citotoxic pe celula animală (CL50%) extractele purificate

EM(8): model experimental de obţinere a culturilor de calus

EM(9): model experimental de obţinere a biomasei prin biotehnologie în culturi in vitro

EM(10): model experimental influenţa factorilor determinanţi asupra randamentului biomasei şi conţinutului în biocompuşi

Diseminare:

1 participare la o conferinta/congres de spectialitate

1 articol ISI

Pentru obţinerea livrabilelor au fost realizate următoarele activităţi:

Activitatea 3.1. Producerea materialului vegetal în culturi ecologice şi verificarea/confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale. Partea a I-a. (P2, P1, CO)

Activitatea 3.2. Fracţionarea extractului cel mai activ farmacologic. (CO)

Activitatea 3.3. Evaluarea cito/genotoxicităţii extractelor purificate (CO)

Activitatea 3.4. Evaluarea acţiunii antialergice topice a extractelor purificate (CO)

Activitatea 3.5. Obţinerea explantelor şi inducerea calusurilor (P3)

Activitatea 3.6. Obţinerea de biomasă produsă prin biotehnologie (P3, CO, P1)

Activitatea 3.7. Obţinerea unui extract standardizat (extract total, amestec extract total-extract purificat, extract purificat) cu acţiune antialergică, Partea I (CO, P1)

Activitatea 3.8. Evaluarea relaţiei doză-răspuns pentru selectarea concentraţiei componentei active. Partea I (P1)

Activitatea 3.9. Optimizarea procesului biotehnologic şi obţinerea extractului biotehnologic. Partea I (P3)

Activitatea 3.10. Obţinerea de biomasă pentru extract antialergic prin procedeu biotehnologic optimizat. Partea I (P3, CO, P1)

Activitatea 3.11. Dezvoltarea şi obţinerea formulelor; evaluarea fizico-chimică a acestora. Partea I. (CO, P1)

Activitatea 3.12. Diseminarea rezultatelor. Partea I. (CO).

Toate activităţile ştiinţifice şi de cercetare au condus la atingerea obiectivelor propuse şi la obţinerea următoarelor livrabile:

EM(5): Model experimental (1) de obţinere a extractelor purificate: extracte purificate uscate (cel puțin 3 extracte purificate) – au fost obținute și caracterizate 6 fracțiuni ale extractului total de Morus alba.

EM(6): model citotoxic pe celula vegetală pentru extractele purificate (CI50). FR6 prezintă o toxicitate ridicată; FR9 și FR10+11 și extractul total prezintă o toxicitate mică, iar FR7+8 este lipsit de toxicitate;

EM(7): model citotoxic pe celula animală (CL50%) extractele purificate. Cea mai mare toxicitate a fost indusă de către fracțiunea 6; extractul total și restul fracțiunilor sunt practic netoxice la concentrațiile testate.

EM(8): model experimental de obţinere a culturilor de calus. și EM(9): model experimental – de obţinere a biomasei prin biotehnologie în culturi in vitro. Au fost realizate obţinerea explantelor şi inducerea calusurilor (inducerea de material biologic vegetal de la Morus alba L. prin calogeneză), având ca sursă primară de material biologic atât lăstari lemnificaţi cât şi lăstari nelemnificaţi;

EM(10): model experimental – influenţa factorilor determinanţi asupra randamentului biomasei şi conţinutului în biocompuşi. Cantitatea cea mai mare de biomasă optimizată prin biotehnologie (realizarea de material biologic vegetal de la Morus alba L. prin calogeneză optimizată), a fost obţinută prin sincronizarea dintre explantul secundar de tip nodal cu muguri axilari 1 indiferent de sursa explantului secundar (lăstari lemnificaţi sau nelemnificaţi), şi dintre mediul nutritiv cu AIA 1 mg/l,, acid 2,4-D 1 mg/l şi ANA 1 mg//l.

Diseminare:

1 participare la o conferinta/congres de spectialitate

1 articol ISI

Rezultatele ştiinţifice au fost diseminate prin:

I. Articol revista FARMACIA: EFFECTS OF TOPICAL APPLICATION OF DRY EXTRACTS ON ALLERGIC CONTACT DERMATITIS INDUCED BY 2,4-DINITROFLUOROBENZENE, IN BALB/c MICE. Autori: ZBÂRCEA CRISTINA ELENA, CHIRIŢĂ CORNEL, NEGREŞ SIMONA, ŞEREMET OANA CRISTINA, ȘTEFĂNESCU EMIL, ANCUCEANU ROBERT VIOREL, OLARU OCTAVIAN TUDOREL, DINU MIHAELA.

II. - - pagina web a proiectului: http://topdermal.umf.ro/

III. - participarea la conferinţe de specialitate cu lucrări ştiinţifice (poster):

1. e-Poster, Congresul Național de Farmacie, ediția a XVI-a” Farmacia - centru al interdisciplinarității”, secția Plante medicinale -actualități în cercetare și utilizarea terapeutică, 28-30 septembrie 2016, București (ID 140), CD: Pharmacobotanical study and toxicity evaluation of Rubia tinctorum L. root extracts. Autori: Dinu Mihaela, Ancuceanu Robert Viorel, Hovaneţ Marilena Viorica, Olaru Octavian Tudorel, Popescu Violeta Carmen, Anghel Adriana Iuliana

2. e-Poster Congresul Național de Farmacie, ediția a XVI-a” Farmacia - centru al interdisciplinarității”, secția Xenobiotice și biotice- evaluarea clinică și non clinică (ID 214), CD:

EFFICACY OF DRY EXTRACTS OBTAINED FROM AMARANTHUS HYPOCHONDRIACUS, PLANTAGO LANCEOLATA AND RUBUS IDAEUS IN AN EXPERIMENTAL MODEL OF ATOPIC DERMATITIS INDUCED BY 2,4- DINITROFLUOROBENZENE, IN BALB/c MICE

Autori: Zbârcea Cristina Elena, Negreş Simona, Chiriţă Cornel, Şeremet Oana Cristina, Pană Roxana Ştefania, Ancuceanu Robert Viorel, Olaru Octavian Tudorel, Anghel Adriana Iuliana, Popescu Carmen Violeta, Dinu Mihaela

Lucrare premiată - Premiul de excelență

3. Poster PRIOCHEM - editia XII - a. Bucuresti, 27 - 28 Octombrie 2016

POLYPHENOLS CONTENT AND TOXICITY ASSESSMENT OF SOME PLANT EXTRACTS WITH ANTI-DERMATITIS POTENTIAL

Autori: Mihaela Dinu, Octavian Tudorel Olaru, George Mihai Nițulescu, Narcisa Băbeanu, Ovidiu Popa, Robert Ancuceanu

Etapa 4 (2017)

I. Obiectivele etapei:

WP1. Obţinerea şi caracterizarea fizico-chimică a extractelor vegetale

1. Obţinerea extractului standardizat

WP2. Dezvoltarea şi optimizarea biotehnologiei de producere in vitro a materialului vegetal

3. Evaluarea influenţei factorilor determinanţi asupra randamentului de obţinere a biomasei şi/sau principiilor active

4. Obţinerea extractului biotehnologic

WP3. Evaluarea acţiunii antialergice şi a toxicităţii extractelor fracționate

5. Stabilirea concentraţiei cu efect farmacologic maxim

WP4. Studii de preformulare şi obţinerea produsului finit

6. Dezvoltarea şi obţinerea formulelor şi evaluarea fizico-chimică

7. Stabilirea specificaţiei tehnice a produsului finit.

8. Validarea procesului de fabricaţie

II. Livrabilele estimate corespunzător obiectivelor sunt:

P(1): – un prototip: extract standardizat;

FM(3): un model farmacologic experimental pentru extractul standardizat;
EM(10): model experimental – influenţa factorilor determinanţi asupra randamentului biomasei şi conţinutului în biocompuşi;
P(2): un prototip: biomasă pentru extract antialergic obţinut prin procedeu biotehnologic optimizat;
P(3): un prototip – produsul farmaceutic antialergic de uz topic;
Diseminare: 1 articol ISI; cerere brevet

Pentru obţinerea livrabilelor au fost realizate următoarele activităţi:

Activitatea 4.1. Producerea materialului vegetal în culturi ecologice şi verificarea/confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale. Partea a II-a. (P2, P1, CO)

Activitatea 4.2. Obţinerea unui extract standardizat (extract total, amestec extract total-extract purificat, extract purificat) cu acţiune antialergică Partea a II-a. (CO, P1)

Activitatea 4.3. Evaluarea relaţiei doză-răspuns pentru selectarea concentraţiei componentei active. Partea a II-a (CO)

Activitatea 4.4. Optimizarea procesului biotehnologic şi obţinerea extractului biotehnologic Partea a II-a. (P3)

Activitatea 4.5. Obţinerea de biomasă pentru extract antialergic prin procedeu biotehnologic optimizat. Partea a II-a. (P3, CO, P1)

Activitatea 4.6. Dezvoltarea şi obţinerea formulelor; evaluarea fizico-chimică a acestora. Partea a II-a. (CO, P1)

Activitatea 4.7. Testarea tehnologiei de formulare în condiţii industriale şi elaborarea specificaţiei tehnice (CO, P1)

Activitatea 4.8. Validarea procesului de fabricaţie (P1, CO)

Activitatea 4.9. Diseminarea rezultatelor (CO, P1, P2, P3).

Toate activităţile ştiinţifice şi de cercetare au condus la atingerea obiectivelor propuse şi la obţinerea următoarelor livrabile:

P(1): un prototip: extract standardizat. S-a obținut extractul standardizat prin amestecarea extractului total din frunze de Morus alba L. cu fracțiunea F obținută (conform procedeului descris în RS 2016), în raport de masă 4:1.

FM(3): un model farmacologic experimental pentru extractul standardizat. S-a demonstrat că aplicarea topică a diferitelor concentrații din extractul MAF a redus reacția de hipersensibilizare indusă de alergenul dinitroflorobenzen (aplicat topic initial, în faza de sensibilizare în concentrație de 0,5%, apoi în faza de elucidare, 0,2% ). Substanța de referință, dexametazona, oprește apariția reacției de sensibilizare. DE50 calculată prin interpolarea pe curba de regresie trasată în funcţie de logaritmul dozei de MAF şi Ef antialergic% este de 899.3 µg/20 µL, în ziua 8 și 1332 µg/20 µL în ziua Z14.

EM(10): model experimental – influenţa factorilor determinanţi asupra randamentului biomasei şi conţinutului în biocompuşi; Cantitatea cea mai mare de biomasă optimizată prin biotehnologie (realizarea de material biologic vegetal de la Morus alba L. prin calogeneză optimizată), a fost obţinută (conform procedeului descris în RS 2016), prin sincronizarea dintre explantul secundar de tip nodal cu muguri axilari 1 indiferent de sursa explantului secundar (lăstari lemnificaţi sau nelemnificaţi), şi dintre mediul nutritiv cu AIA 1 mg/l,, acid 2,4-D 1 mg/l şi ANA 1 mg//l.

P(2): un prototip: biomasă pentru extract antialergic obţinut prin procedeu biotehnologic optimizat; Cele mai bune rezultate experimentale, obținute ca urmare a testării influenței pe care agentul de elicitare (abscisic acid, salicylic acid sau yeast extract) și starea fizică a mediului nutritiv (solid, semi-solid și lichid), au avut-o asupra obținerii de biomasă de la Morus alba L. pentru extract antialergic prin procedeu biotehnologic, a fost varianta experimentală care a combinat agentul de elicitare de tip extract de drojdii 2 g/l și starea fizică a mediului nutritiv lichid, suplimentat cu fitoreglatorii exogeni NAA 1,00 mg/l, 6-BAP 0,50 mg/l și 2,4-D 0,2 mg/l; concentrația biomasei și cea a polifenolilor totali pentru varianta MS0/Y prezintă valori maxime între 7-9 zile de cultivare.

P(3): un prototip – produsul farmaceutic antialergic de uz topic. S-a realizat validarea procesului tehnologic pentru fabricarea produsului Topdermal-gel, ambalat în tuburi x 30mL, pe trei serii consecutive (Seria I : 001/2017, Seria II : 002/2017 si Seria III : 003/2017), pe fluxul tehnologic de obținere a produselor cosmetice din Departamentul Producție - Compartiment Semisolide, Ovule-Supozitoare, Cosmetice.

Livrabile diseminare:

1 cerere de brevet

1 articol ISI

Rezultatele ştiinţifice au fost diseminate prin:

I. Cerere de brevet nr. A/00747/27.09.2017: ”Extract selectiv de Morus alba L. de uz topic cu utilitate în tratamentul dermatitei atopice”

Autori: M. Dinu, R.V. Ancuceanu, O.T. Olaru, MV Hovaneț, A.I. Anghel, S.Negreș, O.C. Șeremet, C.E. Zbârcea, C.E. Pârvu Dinu, A.L. Arsene, C. Drăgoi, C.V. Popescu, A. Dune, M.G. Nițulescu, N. E. Băbeanu, O. Popa, O. Livadariu, Ș.Manea, A. Nicolae

II. Articol revista FARMACIA: CHARACTERISATION, PHARMACOLOGICAL AND BIOCHEMICAL STUDIES ON MORUS ALBA L. EXTRACT AND ITS FRACTIONS

Autori:  Cristina Manuela Drăgoi, Octavian Tudorel Olaru, Mihaela Dinu, Carmen Popescu, Arsene Andreea Letiția, Alina Dune, Alina Crenguța Nicolae, Robert Viorel Ancuceanu, Cristina Elena Zbârcea, Simona Negreș, George Mihai Nițulescu, Oana Cristina Șeremet (adeverință de acceptare nr.34/28.09.2017).

III. Articol revista FARMACIA: “ANTIOXIDANT PROPERTIES OF EXTRACTS FROM MULBERRY (MORUS ALBA L.) CELL CULTURE”

Autori: Narcisa Babeanu, Oana Livadariu, Octavian Tudorel Olaru, Ovidiu Popa, Robert Viorel Ancuceanu, Bruno Stefan Velescu, George Mihai Nitulescu, Mihaela Dinu (adeverință de acceptare nr.35/28.09.2017).

IV. - - pagina web a proiectului: http://topdermal.umf.ro/

V. - participarea la conferinţe de specialitate cu lucrare ştiinţifică (poster):

PRIOCHEM - ediția XIII - a, Bucuresti, 25 - 27 octombrie, 2017:”Evaluation of polyphenol content and toxicity of Morus alba fractionated plant extracts”

Autori: M. Dinu, C. Popescu, O.T. Olaru, A. Dune, N. Băbeanu, O. Popa, M. Nițulescu, R.V. Ancuceanu